1990年，毕业分配到上海电影制片厂担任演员。
1990年，于慧在剧情电影《喋血金兰》中饰演戏院名伶祁曼苓 ；同年，在史蜀君执导的剧情《燃烧的婚纱》中饰演费家世交夏元善的女儿夏若青 。
1991年，于慧搭档祝延平主演石晓华执导电影《情洒浦江》。
1993年，搭档张光北、于小慧主演剧情电影《血染桃花水》，在片中饰演林海雪原中的完达部落寡妇碛的寡妇；同年，与许还山、王志文主演民国剧《大屋的丫环们》，令广大电视观众认识。
1994年，在陈家林执导，刘晓庆、陈宝国主演的古装历史剧《武则天》中饰演唐高宗李治的妃嫔萧淑妃 。
1996年，再次与导演陈家林合作，出演执导的历史剧《汉武帝》，在剧中饰演陈皇后 ；同年，与杨童舒主演电视剧《叶赫那拉公主》 ；同年，与陈道明、葛优合作主演《上海人在东京》 ；同年，凭借主演的农村题材电影《喜莲》获得第3届中国电影华表奖最佳女演员 、第17届中国电影金鸡奖最佳女主角 、第19届小百花奖优秀女主角奖以及第6届中国电影表演艺术学会金凤凰奖。2001年，与盖丽丽、廖京生联合主演都市生活剧《生活秀》，在剧中饰演来双扬 ；同年，在陆剑民 、王志飞主演的军旅题材剧《导弹旅长》中饰演林静 ；同年，与赵燕国彰主演叶鸿伟执导的经典警匪悬疑剧《插翅难逃》 。
2002年，凭借主演孙沙执导的剧情电影《巧凤》获得第8届中国电影华表奖优秀女演员奖 。
2006年，与萨日娜、丁海峰、颜丙燕主演农村题材电影《心灵的天空》，在片中饰演基层的女性计划生育工作者。2007年，在李万年、曹翠芬主演的家庭伦理剧《老伴》中饰演马丙坤的四闺女马建秋；同年，与李颖联合主演家庭情感剧《洒满阳光的小院》，在剧中饰演建筑设备机械厂职工韩素云 。
2008年，主演阚卫平导演，高满堂编剧的作品《金达莱》，凭借该剧获得第三届新农村电视艺术节最佳女主角奖 。
2009年，主演根据黄步千的小说《濠河人家》改编的电视电影《濠河边上的女人》。
2010年，主演的人物传记剧《赵丹》在中央电视台电视剧频道播出，并随着导演翟俊杰、主演邢岷山做客《今夜有戏》 。
2011年，领衔主演张晓春执导的抗日战争剧《母子情仇》，在剧中饰演土匪刘和尚的压寨夫人田彩霞 ；3月，参与朱雨辰、马苏主演的婚姻情感剧《小夫妻时代》，在剧中饰演戴可可的母亲杨惠玲 。
2012年，搭档孙海英主演乡村伦理剧《阳光路上》，在剧中饰演善良坚韧、泼辣进取的梨树村普通农民柳春香 。
2016年，凭借盛林、李勇导演的电影《遥远的约定》获得47届美国纳什维尔国际电影节最佳女主角。
2021年1月13日，参演的电视剧《我的小确幸》播出 ；6月25日，参演的电视剧《大决战》播出 ；7月1日，参演的电影《1921》上映 ；8月29日，参演的电视剧《花开山乡》播出 ；10月30日，参演的电视剧《星辰大海》播出 ；12月11日，参演的电视剧《小敏家》播出 。12月20日，华鼎奖集团在澳门公布了第32届华鼎奖·上汽大众新威然之夜中国百强电视剧满意度调查发布盛典的专家评委会阵容，于慧担任第32届华鼎奖评委 。
2015年12月23日，作为嘉宾出席了第30届中国电视剧飞天奖典礼 。
2016年1月25日，作为颁奖嘉宾出席上海首届公益微电影颁奖。
2017年6月17日，受邀出席第20届上海国际电影节开幕式红毯。
2017年7月21日—22日，携手上影演员剧团登上东方艺术中心，参与《声影》演出，庆祝中国人民解放军建军九十周年 。
2018年，受邀参加“Fashion World”时尚盛典，并获得香港卫视时尚台荣誉大使。